Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) - суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс.

ИФА-анализ крови: что это такое, показания и какие болезни можно обнаружить, плюсы и минусы иммуноферментного метода диагностики

ИФА — это иммуноферментативный анализ: лабораторный метод диагностики, основанный на изучении особенностей работы защитных сил организма и их реакции на ферментативные внешние стимулы.

Тест используется для количественной и качественной оценки возбудителей инфекционных заболеваний и не только. Чаще всего методика применяется так.

С помощью ИФА удается обнаружить вирусы, грибки, бактерии, оценить степень поражения, давность патологического процесса и прочие моменты.

Вопрос, что такое ИФА и как работает методика, довольно сложный для неподготовленного человека. Потому зайдем издалека.

Для начала стоит сказать, что за защиту организма от внешних угроз отвечает иммунная система. Она включает в себя комплекс особых клеток, которые участвуют в работе.

Все иммунные структуры (белые кровяные тельца) можно разделить на:

Гранулоциты. У которых есть ядро.
Агранулоциты. Не имеют такового.

гранулоциты

Белые кровяные тельца обладают способностью вырабатывать антитела и несут их на своей поверхности. Эти вещества умеют разрушать инородные объекты и выступают анализаторами. Что это значит — будет понятно позже.

В качестве иммунных клеток, выступают лейкоциты и лимфоциты разных видов. Именно антитела, которые вырабатывают эти цитологические структуры, играют основную роль в ИФА . Теперь разберемся в вопросе подробнее.

Суть метода ИФА

Двигаемся дальше. Нужно разобраться в терминах и основных физиологических сведениях.

Все клетки человеческого организма несут несколько типов так называемых антигенов. Это особые молекулы, которые отвечают за распознавание цитологических структур своими или чужими.

Антигены делятся еще на несколько видов:

Индивидуальные . Типичны только для конкретного организма. У двух разных людей они похожи, но не идентичны. Выступают специальными маркерами.
Видовые . Присущи определенной группе живых существ. У человеческой популяции — они свои. У обезьян, китов, мышей и так далее — собственные, отличные от людских.

Антигены выступают своего рода бейджами, на которых указана информация о клетках. Они несут генетические сведения о собственной структуре и принадлежности этому конкретному организму.

По индивидуальным молекулам клетки иммунитета распознают «своих». И происходит это с помощью других специальных молекул — антител.

Происходит это примерно так:

Иммунная клетка приближается к другой цитологической единице.
Далее, с помощью антител белое кровяное тельце устанавливает связь с клеткой, которую изучает. Как бы задает запрос, чтобы понять, своя она или чужая.
Вторая цитологическая единица дает ответ, передает сведения о себе. Как бы говоря «я из своих».
Как только иммунная структура получает обратную связь, удостоверяется, что перед ней друг, а не враг — она разрывает канал и двигается дальше, по своим делам.

Точность проверки составляет почти 100%. Бывают исключения. Например, когда начинается ложная реакция и иммунитет атакует собственные клетки организма. Но это патологический вариант.

Бывает и случай, когда аномальные цитологические структуры остаются неопознанными. Пример — злокачественные опухоли, раковые клетки. Так происходит, поскольку они обладают способностью ослаблять бдительность защитников организма, маскироваться «под своих».

Хотя точный механизм пока не до конца понятен.

Таким образом, антигены — это бейджи, маркеры, которыми клетки тела обозначают себя принадлежащими организму. Антитела — молекулы, которые выступают каналом связи и не только.

Если защитная клетка определила другую как чужака, образуется иммунный комплекс.

Происходит это так:

Белое кровяное тельце вызывает подмогу с помощью биохимического сигнала.
На место прибывают другие цитологические структуры, идентичного ряда. Например, лейкоциты.
Они окружают инородный агент и начинают его перерабатывать. Уничтожать.

Так происходит формирование иммунного комплекса «антиген-антитело». Кстати именно он же принимает участие в аллергической реакции. Но это совсем другой вопрос.

Теперь что же касается собственно ИФА (elisa) как анализа.

В его основе лежит способность иммунных комплексов окрашиваться под влиянием особого красителя. Это результат взаимодействия ферментов, которые содержатся в комплексе и самого контрастирующего агента.

Для его проведения ИФА анализа используют очищенные антигены конкретных возбудителей или антитела. В зависимости от того, что намереваются искать.

Оба образца держат в двух разных пробирках. В третьей располагается пигментирующий агент. Как только иммунный комплекс сформировался, его фермент вступает в реакцию с красителем и врачи получают определенный цвет.

Таким образом, иммуноферментативный анализ крови позволяет регистрировать проникновение в тело инородных агентов, инфекций, определять момент их развития, стадию и тяжесть патологического процесса.

Методика основана на физиологических особенностях, клеточной биохимии.

Но это только одна сторона медали. На самом деле, способ применяют и в более редких случаях, речь о которых пойдет в разделе «Что можно обнаружить иммуноферментативным методом».

Показания или когда назначают ИФА

В узком понимании, ключевое основание для проведения теста — это инфекционные болезни. Как реальные, так и предполагаемые. На деле — все несколько сложнее.

Вот основные показания к проведению диагностического мероприятия:

Вероятное заражение гепатитом вирусного генеза . Есть несколько типов патологического процесса. Клинически — они почти неразличимы. Зато подходы к лечению будут очень разными. Потому нужно понять, как, когда и чем заразился человек.

Симптомы, которые становятся основанием для диагностики — это потемнение стула, мочи, желтизна склер, боли в правом боку, слабость и сонливость, кровоточивость тканей.

Паразитарные инвазии . В первую очередь — ищут иммуноглобулины класса G. Поскольку именно они отвечают за развитие аутоиммунных процессов и ответ на проникновение инородных организмов. Это не обязательно простейшие. Сюда же относят макро-организмы. Вроде плоских червей и прочих.
Подозрения на туберкулез . Инфекционное заболевание, которое провоцируется палочкой Коха (микобактерией). Вызывает кашель, кровохарканье, слабость, дыхательную недостаточность. рушит легкие до основания. При этом симптоматики может и не быть.

Годами болезнь течет скрыто. ИФА позволяет выявить подспудные расстройства, вывести их на свет. Это очень важно в плане прогноза.

Высокая вероятность ВИЧ . Патологический процесс также не всегда дает знать о себе симптомами. Десятки лет нарушение способно сохраняться на одном месте, не усугубляясь. ИФА позволяет обнаружить инфицирование, пролечить ВИЧ-позитивного человека, чтобы болезнь не перешла в активную фазу.
Подозрения на кандидоз . Молочница — это грибковое расстройство. В основном поражает женщин и детей. В расстройство вовлекаются слизистые оболочки рта, половых органов. Симптоматика развивается позднее. Но лечение нужно проводить сразу, после заражения. ИФА помогает в ранней диагностике.
Вероятный сифилис . Заболевание развивается очень медленно. Но времени на раздумья нет. Сказать точно, есть ли патологический процесс, позволяет лабораторный анализ.
Риск заражения венерической инфекцией . ЗППП — это широкая группа нарушений. Но они хорошо выявляются с помощью рассматриваемого теста.

Есть показания, которые никак не связаны с заболеваниями и жалобами пациентов. По крайней мере, напрямую. Вот они:

Планирование гестации. Прежде, чем зачать ребенка, будущей матери рекомендуется обследоваться на предмет поражения корью, цитомегаловирусом (герпесом пятого типа), токсоплазмой. Детально оценить характер заражения, сам его факт, дает как раз ИФА. Ранняя диагностика позволяет предотвратить дефекты плода. Повторно иммуноферментативный метод назначается на 12-й неделе беременности, ближе ко второму триместру.
Профилактические осмотры. Медицинские комиссии не обходятся без диагностики на предмет заболеваний, передающихся половым путем и не только. В том числе, это важно при получении медицинской книжки и пр.
Будущее донорство. Органов, крови. Проводят исследования на предмет ВИЧ, гепатита и сифилиса. ИФА оказывает незаменимую услугу.
Подготовка к стационарному лечению.

Это ключевые основания. На самом деле, исследования проводятся для диагностики любых патологических процессов инфекционного ряда. От банального ОРВИ до туберкулеза. И не только.

Что можно обнаружить иммуноферментативным методом

ИФА-тест выявляет не только инфекции, он позволяет оценить гормональный фон, найти специфические онкомаркеры. С его помощью определяют:

Сам факт инфекционного поражения.
Давность такового.
Интенсивность иммунного ответа организма.
Особенности гормонального фона пациента. В том числе, метод ИФА показывает концентрацию половых веществ, позволяет исследовать репродуктивную функцию.
Онкомаркеры.
Специфические метки аутоиммунных патологий.

Вот лишь распространенные проблемы, которые удается обнаружить с помощью специфической диагностики:

Инфекционные поражения. Вирусные, грибковые, актериальные.
Паразитарные инвазии. Глисты и не только они. Другие простейшие тоже попадают в поле зрения.
Заболевания сердца. Как ни странно звучит, с помощью ИФА можно оценить состояние кардиальных структур. Исследуется такое вещество, как торопонин-1. Это соединение выделяется при разрушении мышечных тканей. В частности — миокарда.
Патологии щитовидки, органов эндокринной системы.
Онкологические процессы. По специфическим веществам-маркерам.

Методика в своем роде универсальная. Указана только малая часть возможных сфер применения.

Подготовка к исследованию

В качестве основного биоматериала выступает сыворотка крови, венозная кровь. Методик, которые позволяет повысить точность диагностики, исключить ложные результаты, несколько.

Вот основные рекомендации:

За сутки нельзя принимать жирную и тяжелую пищу.
Не стоит курить. Никотин с большой вероятностью спровоцирует неверные итоги ИФА-обследования.
Никакого спиртного на протяжении минимум нескольких суток.
Кровь сдают строго натощак. Биоматериал помещают в стерильную посуду. Затем получают необходимые фракции: антигены, антитела и работают уже с ними.

В подготовительный период без ограничений разрешена разве что вода.

Идеальный вариант — это полностью отказаться от пищи за 12 часов до предполагаемого обследования. Так результаты будут намного точнее.

Методы проведения теста

Есть несколько модификаций ИФА. Как минимум, их подразделяют на:

Количественные . Которые направлены на выявление объемов искомых веществ в образце. Обнаружить концентрацию соединения удается по цвету получаемого раствора. Чем он насыщеннее, тем больше вещества.

Определить объемы можно с помощью простой калориметрии, другого диагностического метода. Оценки образца. Что и делают специалисты.

Качественные . Гораздо проще в плане проведения. Поскольку цепочка реакций будет меньше. Достаточно сказать, есть искомое вещество в образце или нет.

Выделяют еще десятки вариаций способа: прямой, непрямой, направленный на выявление антигенов или антител и так далее. В любом случае, способ выбирают лабораторные специалисты. Исходя из характера задачи.

Расшифровка результатов

Интерпретацией занимаются иммунологи или другие, более широкие специалисты. Будь то терапевты, инфекционисты или прочие доктора.

Если предметом поиска выступают антитела (иммуноглобулины) — возможна группа находок.

Эти молекулы подразделяются на несколько типов, в зависимости от момента, когда вступают в работу:

LgM . В борьбу идут в самом начале. Обладают свойствами бактерицидов. Основная задача — формирование первичного иммунитета и нейтрализация токсинов, которые вырабатываются в ходе поражения организма инфекционным агентом.

Антитела LgM вырабатываются с самого проникновения инородной структуры в тело. Потому выявить патологический процесс с помощью ИФА можно даже тогда, когда симптомов еще нет.

LgA . Класс иммуноглобулинов, которые так же синтезируются первыми, наравне с LgM. При этом, отвечают не за общую защиту, а за местный иммунитет. Например, за отражение атак на слизистые оболочки.
LgE . Используются для диагностики аллергических реакций. Поскольку формируют комплексы, которые участвуют в разрушении тучных клеток, базофилов, выход гистамина. Почти у ¾ пациентов с аллергией, уровень иммуноглобулина оказывается больше нормы.
LgG . Эти антитела отвечают за стойкий иммунитет. Концентрация повышается медленно, но верно и достигает пика через несколько недель.

Именно эти вещества отвечают за формирование длительных защитных свойств организма, устойчивости к определенному агенту, инородной септической структуре. Кстати, по концентрации LgG можно понять, как давно болеет пациент.

LgD . Функции до конца не изучены. Из того, что известно сейчас — принимают участие в регулировании иммунного статуса. Например, активизируют базофилы, стимулируют выработку специфических, смертоносных для бактерий и вирусов веществ.

Интерпретация проводится по факту обнаружения или количественному составу образца.

Преимущества и недостатки

Есть несколько позитивных моментов, среди плюсов:

Раннее выявление патологий. ИФА-диагностика показывает заболевания на начальной стадии, когда симптоматики еще нет, клиника отсутствует.
Можно обнаружить инфекции в латентной, скрытой форме. Даже такие опасные, как туберкулез или ВИЧ.
Точное определение момента болезни, периода патологического процесса. Например, давности инфицирования.
Очень высокая чувствительность метода. Погрешности практически исключены. Выявить возбудителя болезни, обнаружить другое вещество можно даже в минимальной концентрации.
Большая информативность по сравнению с прочими диагностическими способами. Кровь на ИФА показывает инфекции, которые не регистрируются с помощью прочих методик, бак. посевов, серологических тестов.
Высокая степень автоматизации и простота самого способа. Потому результаты можно получить за день, а то и быстрее.

Во-первых, нужно знать, что искать. Хотя бы примерно. Ферменты, которые используются, имеют сродство к тому или иному веществу. Потому наугад действовать не получится.
Во-вторых, исследование отличается приличной стоимостью. Часто его проводить позволит себе не каждый. Многие поликлиники вне столичного региона не делают ИФА. Как раз из-за дороговизны.

В остальном — это более чем простой и информативный метод. Главное знать, где и как его использовать.

Материалы по теме:

Отоларинголог, аллерголог. Выпускница Варшавского медицинского университета, кандидат наук. Кандидатская диссертация в области отоларингологии — исследование проходимости носовых и околоносовых пазух.Специализацию по аллергологии проходила в Варшавской клинической больнице — на кафедре аллергологии и клинической иммунологии.Многолетний сотрудник отдела аллергологии и клинической иммунологии Центральной клинической больницы в Варшаве.Принимает детей от 3 лет и взрослых с ЛОР-проблемами с аллергией.

Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) — суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс

Сайт предоставляет справочную информацию. Адекватная диагностика и лечение болезни возможны под наблюдением добросовестного врача. У любых препаратов есть противопоказания. Необходима консультация специалиста, а также подробное изучение инструкции!

В связи с развитием клеточных технологий, молекулярной биологии, генетики, физики, химии и ряда других высокотехнологичных дисциплин в повседневную практику внедряются новые высокоточные и высокотехнологичные методы. Данные междисциплинарные тенденции затрагивают и область медицинских знаний, и смежные области биологических, биохимических проблем. За последние десять лет получил широкое распространение и внедрение в массовую практику метод клинической лабораторной диагностики под названием иммуноферментный анализ.

Вообще технологии иммунологических ферментативных и радиологических реакций широко использовались в типировании клеток, культур клеток, различных тканей с начала 80-х годов XX столетия. Однако методы эти были очень трудоемкими, не унифицированными, не стандартизированными, что исключало их использование в лечебно-диагностических целях в массовом порядке. Такими методами пользовались лишь узкие, наукоемкие и высокоспециализированные лаборатории.

Однако с развитием техники, микротехники, производства различных биополимерных материалов стало возможным производить готовые наборы иммуноферментной диагностики, которыми смогут пользоваться лаборатории лечебно-профилактических учреждений широкого профиля. ИФА широко используется для диагностики всевозможных инфекций (хламидиоз, сифилис, цитомегаловирус, токсоплазмоз, герпес и т.д.), как острых, так и хронических, а также скрытых форм, которые протекают без клинических симптомов.Также этот метод применяют для контроля над хроническими заболеваниями. Давайте постараемся разобраться, что это за метод, и какие принципы лежат в его основе?

Компоненты иммуноферментного анализа – иммунная реакция и ферментативная реакция

Иммуноферментный анализ, как видно из названия, состоит из двух разных компонентов – иммунной реакции и ферментативной реакции. Иммунная реакция производит связывание биологических молекул, элементов клетки или микроорганизма, которые собственно и пытаются обнаружить, а ферментная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции. То есть иммунная реакция – это часть комплексной методики, которая собственно обнаруживает искомый микроб. А ферментная реакция – это та часть комплексной методики, которая позволяет перевести результат иммунной реакции в форму, видимую глазом, и доступную для измерения рутинными химическими методиками. Исходя из такой структуры метода иммуноферментного анализа, разберем обе его части по отдельности.

Иммунная реакция, что это? Что такое антитело, антиген?

Что такое иммунная реакция? Что такое антиген?
В первую очередь разберем, что такое иммунные реакции. Иммунные реакции – это специфические реакции связывания антигена с антителом с образованием иммунного комплекса. Что это значит? На поверхности каждой клетки любого организма имеются особые структуры, которые называются антигены. Антигены в целом – это молекулы, которые несут информацию о клетке (подобно информации на бейдже у человека, где указываются основные данные этого человека).

Индивидуальные и видовые антигены – что это? Зачем нужны эти антигены?

Имеются антигены индивидуальные, то есть присущие только данному конкретному организму. Эти индивидуальные антигены разные у всех людей, есть похожие друг на друга, но все равно отличающиеся. Двух одинаковых копий индивидуальных антигенов в природе не существует!

Второй основной тип антигенов – это видовые антигены, то есть присущие какому-либо конкретному виду живых существ. Например, у человека присутствует свой видовой антиген, общий для всех людей, у мышей имеется свой мышиный видовой антиген и т.д. На поверхности каждой клетки обязательно присутствуют видовой и индивидуальный антиген.

Видовой антиген используют клетки иммунной системы для опознавания «свой – чужой».

Как происходит узнавание антигена?

Иммунная клетка связывается с подозрительной клеткой и проводит опознание именно по индивидуальному антигену. В памяти иммунной клетки «записано» как выглядит «свой антиген». Таким образом, если антиген подозрительной клетки совпадает с описанием «свой антиген», значит, эта клетка собственного организма и опасности не представляет. Тогда иммунная клетка «отвязывается» и уходит. А если антиген не совпадает с описанием «свой», тогда иммунная клетка идентифицирует эту клетку как «чужой», а значит потенциально опасный для всего организма. В этом случае иммунная клетка не «отвязывается», а начинает уничтожать опасный объект. Точность такого иммунологического узнавания поражает воображение – 99,97%. Ошибок практически не бывает!

Что такое антитело, иммунный комплекс?
А что представляет собой антитело?

Антитело – это особая молекула, расположенная на поверхности иммунной клетки. Именно антитело и связывается с антигенами подозрительной клетки. Далее антитело передает информацию внутрь клетки, где происходит опознавание, и получает обратный сигнал двух видов «свой» или «чужой». При сигнале «свой» антитело разрушает связь с антигеном и отпускает клетку.

Что такое иммунный комплекс?
При сигнале «чужой» ситуация разворачивается иначе. Антитело не разрывает связь с антигеном, а наоборот, посылая специфические сигналы, вызывает «подкрепление». Биологически это означает, что другие антитела, находящиеся в другой части клетки, начинают перемещаться к участку, откуда идет сигнал опасности, и также образуют связь между собой и пойманным антигеном. В конце концов, антиген оказывается, окружен со всех сторон и прочно привязан.Такой комплекс антиген + антитело называется иммунный комплекс. С этого момента начинается утилизация антигена. Но сейчас подробности процесса нейтрализации антигена нас не интересуют.

Виды антител (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Антитела – это белковые структуры, которые, соответственно, имеют химическое название, которое и используется как синоним слова антитела. Итак, антитела = иммуноглобулины.

Существуют 5 типов иммуноглобулинов (Ig), которые связываются с разными видами антигенов в разных местах человеческого организма (например, на коже, на слизистых, в крови и т. д.). То есть антитела имеют разделение труда. Эти иммуноглобулины называются буквами латинского алфавита – A, M, G, D, E и обозначаются следующим образом – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

В диагностике используют только один вид антител, который наиболее специфичен в отношении определяемого микроба. То есть связывание данного вида антител с определяемым антигеном происходит всегда. Чаще всего применяются IgG и IgM.

Именно этот принцип иммунной реакции (уникальная точность и специфичность узнавания определяемого биологического объекта) лежит в основе иммуноферментного анализа.В силу высокой точности антител в узнавании антигенов, точность всего метода иммуноферментного анализа оказывается также высочайшей.

Подпишитесь на Здоровьесберегающий видеоканал

Ферментативная реакция

Какая реакция – ферментативная? Что такое сродство, субстрат и продукт реакции?

Перейдем к рассмотрению ферментативной реакции в работе метода иммуноферментного анализа.

Что такое ферментативная реакция?

Ферментативная реакция – это химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое. Вещество, на которое действует фермент,называется субстратом. А вещество, которое получается в результате воздействия фермента, называется продуктом реакции. Причем особенность ферментативной реакции такова, что определенный фермент действует только на определенный субстрат. Такое свойство фермента узнавать «свой» субстрат называется сродством.

Таким образом, каждый фермент проводит только одну, специфичную для него реакцию. Ферментов в биологическом мире известно великое множество, равно как и ферментативных реакций. В иммуноферментной диагностике используется лишь несколько ферментативных реакций – не более 10.При этом выбирали такие ферментативные реакции, продуктом которых являются окрашенные вещества. Почему же продукты ферментативной реакции должны быть окрашенными? Потому что для вычисления концентрации вещества по окрашенному раствору существует простой химический метод – колориметрия.

Метод колориметрии – суть и принцип

Колориметрия применяет измерение плотности окраски раствора, а по плотности окраски вычисляют концентрацию вещества.При этом специальный прибор – колориметр измеряет плотность окраски раствора. В колориметрии возможны два варианта зависимости плотности окраски от концентрации вещества – это прямо пропорциональная зависимость или обратно пропорциональная зависимость. При прямо пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем интенсивнее плотность окраски раствора. При обратно пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем ниже плотность окраски раствора. Технически это происходит так: берется несколько растворов с известной концентрацией вещества, измеряется плотность этих растворов, строится график зависимости концентрации от плотности окраски (калибровочный график).

Далее измеряют плотность окраски раствора, концентрацию которого выясняют, и по калибровочному графику находят значение концентрации, соответствующее уровню измеренной плотности окраски раствора.В современных автоматических колориметрах только один раз проводят калибровку, далее аппарат сам строит калибровочную кривую, которая остается в памяти прибора, и измерение происходит автоматически.

В иммуноферментном анализе чаще всего применяются следующие ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза, авидин.

Как же совмещаются иммунологическая и ферментативная реакция в иммуноферментном анализе? Сейчас мы перейдем к рассмотрению собственно иммуноферментного анализа. Какие этапы он включает и что происходит при протекании этих реакций? Иммуноферментный анализ бывает прямой и непрямой.

Прямой иммуноферментный анализ – этапы проведения

В прямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.

Прикрепление антигенов к поверхности лунки и соединение антигена с антителом

Как проходит прямой иммуноферментный анализ? Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. Биологический материал оставляют в лунках на 15-30 минут, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в эти лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Эти антитела получают промышленным способом, а лаборатории покупают уже готовые наборы.Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном.Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними.

Удаление «лишних» антител

Как было указано, антитела к тому же связаны со специфической меткой.Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок просто выливают. В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок. Лунки несколько раз ополаскивают специальным раствором, который позволяет вымыть все «лишние» антитела.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения

Далее начинается второй этап – ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30-60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт). Затем методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Поскольку данная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. Таким образом, в результате проведенного анализа мы получаем ответ, какова концентрация выявляемого микроба или гормона.

Именно так проходит прямой иммуноферментный анализ. Однако сегодня чаще используют непрямой иммуноферментный анализ, поскольку чувствительность и точность непрямого выше, чем прямого. Итак, перейдем к непрямому иммуноферментному анализу.

Непрямой иммуноферментный анализ – этапы проведения

В непрямом иммуноферментном анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а во втором этапе применяют меченые антитела к первым немеченым антителам. То есть получается не прямое связывание антитела с антигеном, а двойной контроль: связывание антител с антигеном, после чего связывание вторых антител с комплексом антитело + антиген. Как правило, антитела для первого этапа – мышиные, а для второго – козьи.

Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителом
Так же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок. Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.

Связывание меченого антитела с комплексом антиген + немеченое антитело
После чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело + антитело + антиген. Однако и меченые, и не меченые антитела вносятся в лунки в избытке. Поэтому нужно опять удалить «лишние», уже меченые антитела, которые не связались с немечеными антителами. Для этого повторяют процедуру выливания содержимого лунок и промывки специальным раствором.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
После чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена. Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.
Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.

Какие заболевания выявляют методом иммуноферментной диагностики?

Перейдем к рассмотрению того, какие заболевания и какие биологически активные вещества выявляются методом иммуноферментного анализа. Вещества, выявляемые методом иммуноферментного анализа, представлены в таблице.

ИФА анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на выявлении в крови специфических антител igg, igm (иммуноглобулинов классов А, M и G) к возбудителям ряда заболеваний. Наличие антител может свидетельствовать как о текущей в настоящее время, так и о перенесенной в прошлом инфекции. Этот метод служит не для обнаружения самого микроорганизма, а антител, которые иммунная система вырабатывает для борьбы с ним. При этом важным является изменение титра антител в динамике. Учитывая сложившуюся эпид. обстановку в Москве и мире по COVID-19, актуальны возможности лабораторной диагностики коронавирусной инфекции по анализу крови ИФА и сдаче ПЦР тестов.

Общая информация

При диагностике инфекционных и прочих гинекологических заболеваний иммуноферментный анализ не может непосредственно «найти» возбудителя как это сделает анализ ПЦР, и определить его специфичные свойства (количество и чувствительность к антибиотикам) как при сдаче бак посева на флору. Он лишь указывает на наличие антител в крови человека, обозначая присутствие постороннего микроорганизма в организме.

ИФА на коронавирус

⚠ ИФА на коронавирус (тест или анализ крови на COVID-19) сдать в нашей лаборатории в настоящее время, к сожалению, нельзя. Если Вы имеете симптомы ОРЗ или были в контакте с заболевшим КОВИД, получите консультацию и рекомендации по алгоритму своих действий по телефону горячей линии 8-800-2000-112 . Горячая линия Оперативного штаба по контролю и мониторингу ситуации с коронавирусом в Москве: +7 (495) 870-45-09 (ежедневно, с 08:00 до 21:00).

ИФА тест на коронавирус igg / igm делается специализированных лабораториях столицы. ИФА диагностика коронавируса на антитела М и Джи рекомендована в следующих случаях:

выявление пациентов перенесших СOVID-19, в том числе и бессимптомно;
обследование работников, имеющих риск инфицирования вирусом SARS-CoV-2;
оценка эпид. обстановки: для выявления контактных лиц из очагов инфекции.

Важность ношения масок при ковид-19

Где сдать анализ методом ИФА на антитела к COVID-19, в т.ч. бесплатно, можно узнать на официальном сайте Департамента здравоохранения г.Москвы.

Суть ИФА анализа

Для диагностики ряда ЗППП и половых инфекций, наряду с ПЦР, сдают анализы крови. Так, иммуноферментный метод (ИФА) обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая составляет 90%. Материалом служит сыворотка венозной крови, взятой натощак. Основное же достоинство ИФА анализа крови на на хламидии, микоплазму, уреаплазму, сифилис и другие возбудители — возможность определения болезни и возможность прослеживать динамику развития процесса, на который указывает уровень антител. Чем острее протекает заболевание, тем выше будет уровень иммуноглобулинов определенного класса в анализе крови. Исследование может проводиться несколько раз, что позволяет по сути оценить эффективность лечения или изменение состояния здоровья.

Показания к исследованию

Сдать ИФА анализ следует прежде всего для диагностики следующих заболеваний и выявления антител к:

коронавирусу,
сифилису,
паразитам (кишечным инфекциям),
ВИЧ инфекции,
вирусным гепатитам А, B, C, E, а также антигенов гепатитов В и С;
герпетическим инфекциям;
кори, краснухе, сальмонеллезу, дизентерии, клещевому энцефалиту;
инфекциям, передающимся половым путем;
хеликобактеру пилори;
герпетическим инфекциям и др.

Другие области применения ИФА анализа крови:

Определение содержания гормонов в сыворотке крови;
Тесты на онкомаркеры;
Исследование иммунного и интерферонового статуса организма;
Диагностика аллергии на продукты, лекарства и т.д.

Что показывает ИФА анализ

IgM
наличие этого класса иммуноглобулинов говорит об остром инфекционном процессе в организме. Отсутствие IgM может говорить как об отсутствии конкретного возбудителя, так и показывать переход инфекции в хроническую стадию.

IgA
при отрицательном результате теста на IgM чаще всего свидетельствует о хронической или скрыто протекающей инфекции. IgM и IgA (совместное присутствие) — два положительных результата говорят о разгаре острой фазы заболевания.

IgG
говорит либо о хронизации заболевания, либо о выздоровлении и выработке иммунитета к инфекции.

Результаты ИФА анализа

В зависимости от содержания анализа в бланке могут быть представлены данные в виде таблицы антител или антигенов (см. ниже) с пометками об отрицательной или положительной реакции, либо будет указан результат ив количественном формате.

IgG	IgM	IgA	Что означает результат
(-)	(-)	(-)	Нет инфекции
(-) или (+)	(+)	(-) или (+)	Текущая инфекция
(+)	(-)	(-)	Перенесенная или текущая инфекция
(-) или (+)	(-)	Текущая или хроническая инфекция

Динамика антител в ИФА анализе крови

Первыми в анализе появляются Ig M-антитела. Как правило это происходит через 1-3 недели с момента заражения, как скоро появятся антитела зависит от инфекции и от особенностей человека. Появляются симптомы острой инфекции. Обнаружение Ig M- антител в анализах крови указывает на наличие острой фазы заболевания или на обострение хронических инфекционных заболеваний.

Через месяц начинают вырабатываться Ig A- антитела. Основная часть их концентрируется на слизистых оболочках, где реализуется их защитная функция. Последними появляются Ig G-антитела, как правило, на 4 неделю с момента заражения. После лечения, например, хламидиоза, микоплазмоза, трихомониаза их уровень в ИФА анализе крови значительно снижается, так как иммунитет против этих заболеваний у человека не развивается.

Возможные варианты сочетаний антител:
IgM(+) (IgA, IgG не определялись) – процесс выздоровления;
IgM(-), IgG(+), IgA(+) – хроническая инфекционная патология;
IgM, IgG, IgA (все с – значением) – отсутствие защитных механизмов к инфекциям;
IgG(+/-) и IgA(+/-), IgM(+) – острый процесс;
IgM(-), IgA(-), IgG(+) – постинфекционный иммунитет;
IgM, IgG, IgA(+) – хроническая патология в стадии обострения.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) — один из видов иммунохимического анализа. Он основан на высокоспецифической иммунологической реакции антигена (АГ) с соответствующим антителом (АТ) с образованием иммунного комплекса. При этом один из компонентов конъюгирован с ферментом. В результате реакции фермента с хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

Стадия узнавания исследуемого соединения специфическим антителом;
Стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
Стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

В реакции участвуют:

Твердая фаза;
АГ и АТ;
Конъюгат (антиген или антитело, меченые ферментом);
Ферментный маркер;
Субстрат;
Стоп-реагент (чаще всего применяют серную кислоту).

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Антигены и антитела

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант.
Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые АТ могут быть поли- или моноклональными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgG1, IgG2).
Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в образцах.

Ферментные маркеры: наибольшее применение нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза.

Субстраты

Выбор субстрата, в первую очередь, определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция «фермент-субстрат» высокоспецифична.

Для ПХ в качестве субстрата используют 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ хромоген). Происходит цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанного определяемого вещества;
Для ЩФ субстратом является 4-нитрофенилфосфат;
β-D-галактозидаза катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы.

Классификация ИФА

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1 — по типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА:

В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним;
Для неконкурентных методов характерно присутствие на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2 — по принципу определения исследуемого вещества:

Прямое определение концентрации вещества (АГ или АТ). Используют антитела к исследуемому веществу, соединенные со специфической меткой. В этом случае метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу;

Непрямое определение концентрации вещества – по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

3 — по типу результатов:

Конкурентный ИФА

На твердой фазе иммобилизованы специфические моноклональные антитела;
В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях. Проводят инкубацию и отмывку;
Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем;
Проводят учет результатов на ИФА-ридере. Концентрация определяемого вещества обратно пропорциональна оптической плотности.

Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Неконкурентный «сэндвич» – вариант ИФА

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА.

На твердой фазе иммобилизованы моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела;
В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают;
В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела —конъюгат. После инкубации проводят отмывку для удаления несвязавшихся антител;
Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем;
Проводят учет результатов на ИФА-ридере. Концентрация определяемого вещества прямо пропорциональна оптической плотности.

Качественный анализ часто используют при скрининговых исследованиях и диагностике инфекционных заболеваний. Результат исследования определяется при сравнении его оптической плотности с расчетной величиной критической оптической плотности (ОПкрит., «Cut-off»).

Формулу для расчета «Cut-off» указывают в инструкции к тест-системе. В расчете «Cut-off» могут участвовать как усредненные значения оптических плотностей положительных и отрицательных контролей, так и оптическая плотность специального контрольного образца — контроля уровня среза.
Если оптическая плотность образца выше, чем Cut-off, образец считается положительным на специфические антитела.

Для полуколичественного варианта проведения методики рассчитывают отношение между средней оптической плотностью образца и оптической плотностью Cut-off.

Образцы рассматриваются как:

положительные, если отношение более 1,1;
сомнительные, если отношение 0,9–1,1;
отрицательные, если отношение менее 0,9.

Сомнительные результаты анализа нельзя однозначно интерпретировать и для уточнения результата необходимо повторить обследование через 1–2 недели.

Исследования на половые инфекции методами ИФА и ПЦР

Антитела (иммуноглобулины, Ig) — специфические белки-защитники, вырабатываемые лейкоцитами (белыми кровяными тельцами) в ответ на появление в организме чужеродного генетического материала (вирусов, бактерий, простейших).

Иными словами, результат иммуноферментного анализа (ИФА) показывает не факт наличия инфекционного агента (инфекции) в организме, а состояние иммунитета к этому инфекционному агенту.

Таким образом, на основании результатов исследования крови методом ИФА можно лишь опосредованно (косвенно) судить о наличии /отсутствии инфекционного агента (вирусов, бактерий, простейших) по ответной реакции на него иммунной (защитной) системы организма.

В зависимости от срока давности существования в организме человека вирусов, бактерий, простейших вырабатываются антитела классов А, M, G (IgА, IgM, IgG).

Антитела классов А, M, G свидетельствуют о свежем, недавнем или давно существующем заражении соответственно.

По комбинации количественных показателей антител данных классов можно судить об обострении или снижении активности хронического инфекционного процесса, или повторном заражении.

Данная информация представляет в гинекологии и дерматовенерологии известную ценность, позволяя ответить на вопрос «кто кого заразил?» и подобрать лечение в зависимости от длительности инфекционного процесса.

Исследование крови методом ИФА в гинекологии широко используют для диагностики микоплазмоза, уреаплазмоза, трихомоноза, гарднереллеза, гонореи, TORCH-инфекций (токсоплазмы, краснухи, цитомегаловирусной инфекции и герпеса).

В случае низкой иммуногенности инфекционного агента (инфекции) либо недостаточной активности иммунной системы выработка антител (иммуноглобулинов классов А, M, G) может отсутствовать или быть диагностически незначимой при фактическом (реальном) наличии инфекционного агента (инфекции) в организме по данным полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Слабой иммуногенностью (способностью существовать незаметно для иммунной системы) обладают микоплазмы, уреаплазмы, трихомонада.

Результаты иммуноферментного анализа (ИФА) в ряде случаев могут быть ложноположительными, т.е. при фактическом отсутствии инфекционного агента (инфекции) в организме иммуноферментный анализ (ИФА) определяет наличие антител к нему.

Высокая частота ложноположительных реакций часто отмечается при диагностике методом ИФА трихомоноза (трихомониаза).

Низкой иммуногенностью инфекционного агента (бактерий, вирусов, простейших) и индивидуальными особенностями иммунитета человека объясняется кажущееся противоречие результатов ИФА и ПЦР, при котором исследование методом ИФА не находит инфекцию, а метод ПЦР свидетельствует о наличии инфекции в организме.

Таким образом, диагностика инфекционных заболеваний, включая инфекции, передаваемые половым путем (анализ на скрытые инфекции), требует комплексной (совокупной) оценки результатов нескольких диагностических методов.

Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет выявить специфические белки, возникающие в организме человека при наличии онкологического процесса — так называемые онкомаркеры.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР (полимеразная цепная реакция, ПЦР-анализ) — это метод лабораторной диагностики различных вирусов, бактерий, простейших на основании выявления их генетического материала (РНК и ДНК) в исследуемом биологическом материале: в крови, слюне, эякуляте (сперме), моче, выделениях из половых путей, мазках, соскобах и т.д.

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение типоспецифического (т.е. характерного для конкретного микроорганизма) участка РНК или ДНК, вследствие чего нарабатывается достаточное для точной идентификации данного микроорганизма количество РНК или ДНК.

Метод ПЦР является молекулярно-генетическим методом исследования.

В настоящее время полимеразная цепная реакция (ПЦР) является самым точным и чувствительным методом диагностики скрытых инфекций (инфекций, передаваемых половым путем) и иных инфекционных заболеваний после культурального исследования (посева на среду).

Таким образом, результаты исследования методом ПЦР свидетельствуют о наличии/отсутствии непосредственно инфекционного агента (вирусов, бактерий, простейших) в исследуемом органе (образце клеток, ткани).

Основным преимуществом метода ПЦР является высокая чувствительность и специфичность, т.е. способность определить возбудителя заболевания при наличии в пробе всего нескольких молекул его ДНК или РНК. Поэтому возможным становится обнаружение возбудителей заболеваний (в том числе скрытых инфекций) даже в тех случаях, когда другими методами их выявление не возможно.

Специфичность ПЦР (т.е. способность безошибочно определить данный вирус, бактерию) близка к 100%, что значительно превышает возможности микроскопии, иммуноферментного анализа (ИФА).

По этой причине исследование методом ПЦР нашло широкое применение в практике врачей Курортной клиники женского здоровья при экспертном выявлении скрытых инфекций: хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза, трихомоноза, бактериального вагиноза, вирусов папилломы человека и других вялотекущих либо скрыто существующих инфекций.

Следует учитывать, что результат ПЦР-исследования распространяется лишь на орган (ткань), клеточный материал которого с помощью мазка-соскоба забирается на исследование.

Это вносит известные ограничения, не позволяющие в ряде случаев судить о распространенности процесса. Например, выявление хламидий в канале шейки матки не позволяет утверждать присутствие хламидий в маточных трубах, ткани яичников, суставах, легких и иных органах и тканях.

Таким образом, метод ПЦР (ПЦР-анализ) отличается высокой информативностью и достоверностью относительно инфицирования (заражения) конкретного органа (участка ткани), а метод ИФА косвенно показывает распространенность процесса и возможную вовлеченность в инфекционный процесс органов и тканей, недоступных для прямой диагностики.

Методы ИФА и ПЦР взаимо дополняют друг друга. В рутинной (повседневной) практике Курортной клиники женского здоровья мы применяем все методы исследования для быстрой, достоверной диагностики.

Забор крови и мазков с целью проведения исследований методами ИФА и ПЦР в Курортной клинике женского здоровья осуществляют профессионально подготовленные акушерки, прошедшие специализацию по лабораторной диагностике. Забор крови и мазков выполняется безболезненно и в комфортных условиях.

Особенности диагностики инфекций, передаваемых половым путем (скрытых инфекций), и условия подготовки к исследованиям подробно изложены на нашем сайте в соответствующих статьях.

Мы в полном Вашем распоряжении при возникновении любых сомнений или пожеланий.

Мы работаем без выходных и праздничных дней:

понедельник — пятница с 8.00 до 20.00,
суббота, воскресенье, праздничные дни с 8.00 до 17.00.
Прием по предварительной записи по многоканальному телефону 8 (800) 500-52-74 (звонок по России бесплатный), или +7 (928) 022-05-32 , или info@kurortklinika.ru.

Вопросы и ответы

Вопрос: Анализ ИФА, что это в гинекологии?
Ответ: Иммуноферментный анализ (ИФА) — это метод лабораторной диагностики, заключающийся в выявлении специфических (индивидуальных для каждого микроорганизма, вируса) антител.
На основании результатов исследования крови методом ИФА можно лишь опосредованно (косвенно) судить о наличии /отсутствии инфекционного агента (вирусов, бактерий, простейших) по ответной реакции на него иммунной (защитной) системы организма.

Вопрос: Хламидиоз в крови как выявить?
Ответ: Хламидиоз в крови можно выявить методом иммуноферментного анализа (ИФА). Иммуноферментный анализ позволяет определить в крови антитела классов A, M, G к хламидии. Чувствительность выявления хламидий методом ИФА (точность метода) составляет 50-60%.
Иными словами, иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет определить в крови наличие антител (иммуноглобулинов (Ig) классов А,М,G) к хламидии. Специфические иммуноглобулины классов A, M, G вырабатываются организмом в ответ на свежее (Ig A), недавнее (Ig M) появление хламидий и длительное (Ig G) носительство хламидий.

Вопрос: Анализ ПЦР положительный после лечения. Как такое может быть?
Ответ: Положительный ПЦР после лечения свидетельствует о наличии ДНК возбудителя инфекции: вируса или бактерии. При этом, если ПЦР-мазок был взят ранее, чем через 30 дней после последнего приема антибиотиков, положительный анализ ПЦР может свидетельствовать о выявлении мертвых бактерий или вирусов.
Положительный анализ ПЦР после 30 дней с момента окончания лечения свидетельствует о сохранении инфекции и устойчивости инфекции к лечению, то есть о необходимости продолжить лечение.

Вопрос: ПЦР анализ, что это такое?
Ответ: ПЦР (полимеразная цепная реакция, ПЦР-анализ) — это метод лабораторной диагностики различных вирусов, бактерий, простейших на основании выявления их генетического материала (РНК и ДНК) в исследуемом биологическом материале: в крови, слюне, эякуляте (сперме), моче, выделениях из половых путей, мазках, соскобах и т.д.
Результаты исследования методом ПЦР свидетельствуют о наличии/отсутствии непосредственно инфекционного агента (вирусов, бактерий, простейших) в исследуемом органе (образце клеток, ткани).

Что такое ИФА?

Иммуноферментный анализ (ИФА) — лабораторное исследование основанное на высокой избирательности и специфичности иммунологических реакций “антиген-антитело”. Суть метода — выявление специфических антител с помощью специальных биохимических реакций, которые помогают определить присутствие или отсутствие антител и их количество.
Есть десятки модификаций ИФА. Его применяют для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций и для определения наличия антител классов ( IgA IgM IgG) к антигенам различных возбудителей болезней. Методом ИФА можно определить уровень гормонов, иммуноглобулинов, иммунологических комплексов и других биологически активных веществ, определить антитела к любой половой инфекции. Материалом для исследования может служить кровь, спинномозговая жидкость, содержимое стекловидного тела, околоплодные воды и т.д.

В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом, а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня.

Какие инфекции можно выявить методом ИФА

В основном ИФА применяется для диагностики сифилиса (в комплексе с другими реакциями), ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов. Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции, цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций. Метод ИФА используется также для определения антител при различных инфекционных заболеваниях, уровня гормонов, аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний.

Определение наличия и уровня антител в крови не рекомендуется применять для первичной диагностики инфекций, передающихся половым путем. Единственное исключение — по результатам ИФА возможно распознавание сифилиса в комплексе с реакцией микропреципитации. Но наличие антител в сыворотке крови может свидетельствовать только о контакте организма с возбудителем в данное время или ранее.

Исследование наличия и уровня антител различных классов в некоторых случаях помогает определить стадию инфекционного процесса.

К сожалению, такое важное преимущество ИФА, как количественное определение антител не имеет большого значения в практической работе — т.е. не позволяет точно установить диагноз и не влияет на дозировку и сроки назначения лекарственных средств.

Преимущества ИФА относительно других методов обнаружения антигенов и антител:

— легкость в отслеживании динамики развития процесса инфекционного заболевания.

Метод иммуноферментного анализа используется для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций и для определения наличия антител классов (IgA, IgM, IgG) к антигенам различных возбудителей (вирусные гепатиты, ВИЧ, сифилис, TORCH, хламидиозы, паразитозы). С помощью ИФА можно определить антитела к любой инфекции, при условии, что организм их выработал. Этот метод позволяет различать острые и хронические формы заболеваний, выделять стадию заболеваний и выявлять практически здоровых носителей и контролировать вакцинацию.

Для постановки диагноза по методу ИФА используют лабораторные тесты для идентификации возбудителя, инструментальные методы обследования и клиническую диагностику. Надо учитывать, что только по наличию тех или иных антител не может быть поставлен достоверный диагноз заболевания. Необходимо одновременно выявлять антитела к возбудителю методом ИФА и выявлять возбудителя методом ПЦР или другими методами.

ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Антинуклеарные антитела— это аутоантитела к антигенам ядра клеток. Они образуют иммунные комплексы и откладываются на базальных мембранах различных тканей и органов, тем самым вызывая воспаление и повреждение тканей и сосудов. Образование таких антител характерно для системных аутоиммунных заболеваний. Исследование на антинуклеарные антитела проводится если врача подозревает системное аутоиммунное заболевание.

Антитела к двухспиральной ДНК образуются при системных аутоиммунных поражениях соединительной ткани. Эти иммунные комплексы откладываются на тканях, стенках сосудов и вызывают их повреждение. Антитела к двухспиральной ДНК специфичны для системной красной волчанки.

Антитела к растворимым нуклеарным антигенам (ENA скрин) — скрининговый тест на антитела к растворимым ядерным антигенам — (SSA(Ro), SSB(La), Sm, RNP, Jo1, Scl70). Образуются при многих системных аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, синдром Шегрена, склеродермия, полимиозиты, смешанное заболевание соединительной ткани, ревматоидный артрит). Положительные значения анализа являются аргументом наличия у больного аутоиммунного процесса и является показанием для дифференцированного определения титров антител к различным ENA для более точной постановки диагноза. Для дифференцированного определения антител к растворимым ядерным антигенам применяется иммуноферментный анализ -комбинированный ENA.

Антикардиолипиновые антитела IgG, IgM — это аутоантитела к отрицательно заряженным или нейтральным фосфолипидам, фосфолипидсвязывающими сывороточными белками. Антитела к фосфолипидам нарушают нормальное функционирование эндотелия кровеносных сосудов, вызывая сужение сосудов и образование сосудистых тромбов. Обследование назначают при подозрении на антифосфолипидный синдром (рецидивирующие венозные и/или артериальные тромбозы).

Качественное и полуколичественное иммуноферментное определение специфических антител класса IgG к цитрулиновому пептиду. Тест система предназначена для диагностики ревматоидного артрита различных стадий, в т.ч. начало заболевания, когда клинические проявления слабо выражены. Эффективность теста для пациентов с клинически подтвержденным ревматоидным артритом составляет от 78 до 88%.

Ревматоидный фактор обнаруживают при ревматоидном артрите, особенно при наиболее частой и распространенной форме хронического воспаления суставов, именуемой синовиит. 75-80% больных ревматоидным артритом имеют ревматоидный фактор, однако, он не специфичен для ревматоидного артрита так как обнаруживается у здоровых лиц и при ряде других заболеваний.

С реактивный белок — маркер воспалительного процесса. Использование высоко чувствительных импортных тест-систем позволяет выявлять С реактивный белок не только при высоко активном воспалительном процессе, но при хроническом и вялотекущем.

ANCA скрин— определение аутоантител к цитоплазматическим антигенам нейтрофилов (протеиназа 3, миелопероксидаза ). Анализ назначают при подозрении на системные васкулиты, гломерулонефрит.

Все перечисленные исследования доступны в лаборатории клинической иммуногенетики института

Все вышеназванные анализы и методы диагностики доступны всем, без исключения, пациентам, обратившимся в отделение лабораторной диагностики клиники.

Научная электронная библиотека

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Из-за разнообразия объектов исследования – от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

Одним из принципов классификации методов ИФА является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с эти все методы можно разделить на две группы –
гомогенные и гетерогенные. Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным. Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения [16].

В настоящее время EMIT (гомогенный ИФА) широко распространен во всем мире наряду с твердофазным ИФА (тИФА). EMIT по сравнению с тИФА является более экспрессным (до 2-х минут) и менее трудоемким, хотя менее чувствительный, и поэтому используется только в качественном анализе.

Возможна также классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.

10.tif

Рис. 10. Конкурентный (а) и неконкурентный (б) ИФА

Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод.
Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.

«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Другим типом классификации схем ИФА является разделение по типу определения концентрации анализуемого вещества:

1) прямое определение образовавшихся иммунокомплексов (аналитический сигнал прямо пропорционален концентрации определяемого вещества) – прямой ИФА;

2) определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступившими в реакцию компексообразования антител – непрямой ИФА.

Так, среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

Прямой конкурентный формат ИФА использует в качестве меченного ферментом реагента одного из участников иммунохимической реакции (рис. 3) – определяемое соединение или специфический к нему диагностический реагент (антитела). В результате схема ИФА состоит из 3-х стадий:

– сорбции (иммобилизации) специфических антител, либо конъюгата антигена,

– аналитической стадии: конкурентной реакция Аг-Ат с участием меченого ферментом реагента (антигена или антител),

– фермент-субстратной реакции, в результате которой образуется окрашенный (или люминисцентный) продукт.

Например, на полистирольный планшет иммобилизуют специфические антитела (рис. 11 в) иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела. На второй стадии к иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. В этой схеме меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связывание с иммобилизованными специфическими антителами.

11.tif

Рис. 11. Виды конкурентного ИФА:
а – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых антивидовых антител; б – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых специфических антител; в – прямой конкурентный ИФА с иммобилизацией специфических антител и использованием меченого антигена (аналита)

Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.

В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель
(рис. 11 а, б). Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА (рис. 11 а). На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина аналитического сигнала в этом случае находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.

Применение универсального реагента – меченых антивидовых антител – даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.

ИФА наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях широко используется в ХТЛ, бюро судмедэкспертизы, клинико-диагностических лабораториях, медицинских центрах. Чаще всего применяется полуколичественный вариант методики, т.к. в большинстве случаев необходимо дать заключение о том, превышает ли уровень метаболитов ПАВ в образце определенную пороговую концентрацию. Однако метод ИФА может использоваться (и используется в некоторых случаях) для количественного определения метаболитов ПАВ с высокой чувствительностью – до 10–9 г/л.

Отдельно следует выделить иммунохимический метод выявления фактов употребления наркотиков в отдаленные промежутки времени (до 4 месяцев после последнего употребления ПАВ), основанный на определении антител к наркотическим веществам в крови человека [4, 5]. Данный метод использует прямую неконкурентную схему ИФА.

Компоненты, используемые в ИФА

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тирозина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемилюминесцентных.

3. Антигены и антитела.

Аг и Aт, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. Кроме того, Аг должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные Аг вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности Ат распад комплекса Аг-Ат приводит к удалению связанного Аг из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации Аг (Aт) в испытуемых образцах.

4. Получение конъюгата.

Конъюгат – это антиген или антитело, «сшитые» с ферментной меткой или белком-носителем. Получение коньюгата – один из важных этапов разработки ИФА.

При синтезе конъюгата с ферментом подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент – способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело – антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы ИФА. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с Аг или Aт и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и Аг или Aт осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорбция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсорбируемого вещества. В стандартных наборах ИФА используются 96-тилуночные прозрачные полистирольные планшеты.

12.tif

Рис. 12. Набор для ИФА-определения наркотических еществ в биологических жидкостях: – планшет с нанесенным антигеном; 2 – положительный и отрицательный контрольный образец; 3 – реагент для выявления образовавшихся иммунных комплексов; 4 – растворы буфера для приготовления анализируемых образцов; 5 – раствор буфера для проведения фермент-субстратного окрашивания; – раствор для остановки реакции окрашивания субстрата; – инструкция по применению

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты – бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Готовый набор для ИФА-определения наркотических веществ в биологических жидкостях выглядит следующим образом (рис. 12).